488 Caspase-3活细胞分析试剂盒说明书

活细胞分析试剂盒包含 488 Caspase-3底物和Ac-DEVD-CHO Caspase-3/7抑制剂。 488 Caspase-3 Substrate为基于Caspase-3/7活力检测细胞凋亡提供了有效的工具，适用于荧光显微观察和流式细胞仪分析。

相较于其它基于（FLICA）分析的 Caspase 的荧光底物或荧光抑制，试剂盒内提供的Substrate 检测Caspase-3/7 活性的同时不会抑制完整细胞的凋亡过程。Substrate由耦合Caspase-3/7 DEVD识别序列的荧光DNA染料组成。Substrate 最初无荧光，其会穿过细胞膜进入细胞质。在凋亡细胞中Caspase-3/7剪切Substrate释放高亲和性的DNA 染料，这种染料迁移到细胞核标记DNA 并发出明亮的绿色荧光。Substrate 是双功能的，既可以检测 Caspase-3/7 活性，又能可视化细胞核在细胞凋亡进行中的形态学变化。

1. 实验优化
下面提供的实验步骤根据终点法检测制度。488 Substrate 可进行细胞长时间孵育过程研究。细胞密度、底物浓度和抑制剂浓度可能需要优化。推荐底物浓度1-10 μM之间。细胞可在培养基、PBS或其他的缓冲液中孵育底物。对于贴壁细胞，建议更换新鲜含有底物的培养基，以防背景的不均一性。底物孵育后换液或洗涤细胞等操作可自由选择。
2. 对照设定

推荐设定以下对照：

A. 阴性对照：不诱导凋亡的细胞

B. 阳性对照：诱导凋亡的细胞

C. 抑制剂对照：诱导细胞凋亡同时（或提qian10-30 min）孵育Caspase-3/7抑制剂，最后再添加 488 Caspase-3底物。

3.  抑制剂对照

试剂盒中所提供的Caspase-3/7 抑制剂 Ac-DEVD-CHO 可用来确认Caspase-3/7 依赖于 488 的荧光信号。对于抑制剂对照，抑制剂的终浓度应至少是底物浓度的2倍（例如当使用5 μM 488 底物时，Ac-DEVD-CHO浓度为 10 μM）。添加底物前在室温下孵育Ac-DEVD-CHO 15-30 min，加入底物后，孵育液中继续保留抑制剂。Ac-DEVD-CHO 是可逆的竞争性抑制剂。对于某些细胞类型有效的Caspase-3/7 抑制剂需要使用不可逆的抑制剂，如Z-DEVD-FMK，或需要在凋亡诱导之前或诱导过程中添加抑制剂。

4. 流式细胞仪分析

4.1 选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。

4.2 对于贴壁细胞，实验前先用胰蛋白酶或其他方法消化细胞。

4.3 用细胞培养基或合适缓冲液重悬细胞，使细胞密度达到106个/mL数量级。

4.4 添加200 μL 细胞悬液至流式细胞试管。

4.5 抑制剂对照样本，用Ac-DEVD-CHO 处理细胞（见上文）。

4.6 200 μL细胞悬液中加5 μL 0.2 mM 的Substrate并立即混匀使底物浓度为5 μM。不同类型细胞最佳底物浓度可能不同，需进一步优化。

4.7 室温避光孵育15-30 min。

4.8 加入300 μL细胞培养基或PBS，使用流式细胞仪分析，选择检测绿色荧光的通道（激发/发射：485/515 nm）。

5. 荧光显微镜观察

5.1 选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。

5.2 抑制剂对照样本，用Ac-DEVD-CHO 处理细胞（见上文）。

5.3 用含5 μM Substrate 的新鲜培养基或PBS对细胞进行换液（见试验优化）。对于抑制剂对照组，抑制剂与底物一同孵育。

5.4 室温孵育30 min 或更长时间。

5.5 PBS或其它缓存液清洗细胞，荧光显微镜观察细胞，使用观察绿色荧光的滤片（激发/发射：485/515 nm）。

6. 荧光酶标仪检测

6.1 将贴壁细胞生长在黑色96孔板中；对于悬浮细胞，调整密度至106个/mL，每孔加入0.2 mL细胞悬液。

6.2 选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。（注意：细胞可能在管或瓶中处理，然后转移到 96孔检测板。）

6.3 抑制剂对照样本，用 Ac-DEVD-CHO 处理细胞（见上文）。

6.4 对于悬浮细胞，直接添加Substrate 混匀。对于贴壁细胞，用含有5 μM Substrate的新鲜培养基或PBS对细胞进行换液（见试验优化）。对于抑制剂对照组，抑制剂与底物一同孵育。

6.5 细胞可以在含有Substrate 的培养基中直接观察。

6.6 对于悬浮细胞，轻轻震荡重悬细胞。荧光酶标仪设置激发波长488 nm和发射波长520 nm。建议贴壁细胞使用底部阅读方式。贴壁细胞密度的变化可能导致不准确的读数。

运输及保存方法